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色谱仪的分离技术-凯发k8官方网站

发布时间:2021-09-16

        
    色谱是一种重要的生物物理技术,可以分离、鉴定和纯化混合物的成分,用于定性和定量分析。蛋白质可以根据其大小和形状、总电荷、表面疏水基团以及与固定相的结合能力进行纯化。基于分子特征和相互作用类型的四种分离技术使用离子交换、表面吸附、分配和尺寸排阻机制。其他色谱技术基于固定床,包括柱色谱、薄层色谱和纸色谱。柱层析是最常用的蛋白质纯化方法之一。


  色谱的原理是混合物中的分子被施加到表面或固体上,流体的固定相(固定相)在流动相的帮助下移动时相互分离。对分离过程有效的因素包括与吸附(液-固)、分配(液-固)和亲和力相关的分子特征或它们分子量之间的差异。由于这些差异,混合物中的一些组分在固定相中停留的时间更长,它们在色谱系统中移动缓慢,而其他组分快速进入流动相并更快离开系统[。

      
  基于这种方法,三种组分构成了色谱技术的基础。

  固定相:该相总是由“固体”相或“吸附在固体载体表面的一层液体”组成。
  流动相:该相总是由“液体”或“气体成分”组成。


  分离的分子

  固定相、流动相和混合物中所含物质之间的相互作用类型是有效分离分子的基本成分。基于分配的色谱对于小分子如氨基酸、碳水化合物和脂肪酸的分离和鉴定非常有效。然而,亲和色谱(离子交换色谱)在分离大分子如核酸和蛋白质方面更有效。纸色谱用于蛋白质的分离和蛋白质合成的相关研究;气相色谱法用于分离醇、酯、脂和氨基,并观察酶的相互作用,而分子筛色谱法特别适用于蛋白质分子量的测定。琼脂糖凝胶色谱法用于纯化核糖核酸、脱氧核糖核酸颗粒和病毒。


  色谱中的固定相是涂在固相表面的固相或液相。流经固定相的流动相是气相或液相。如果流动相是液体,称为液相色谱(lc),如果是气体,称为气相色谱(gc)。气相色谱法适用于气体、挥发性液体和固体物质的混合物。液相色谱特别适用于热不稳定和不挥发的样品。


  除了分离,使用色谱作为定量分析方法的目的是在合适的时间间隔内实现令人满意的分离。为此已经开发了各种色谱方法。其中包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱、高压液相色谱和亲和色谱。
     

    色谱类型


  柱色谱
  离子交换色谱法
  凝胶渗透(分子筛)色谱法
  亲和色谱法
  纸色谱分析法
  薄色层分离法
  气相色谱分析
  染料配体色谱法。
  疏水相互作用色谱
  假亲和色谱。
  高压液相色谱


  柱色谱
  由于蛋白质在大小、形状、净电荷、使用的固定相和结合能力方面具有不同的特征,因此这些特征成分中的每一种都可以通过色谱法纯化。在这些方法中,最常用的是柱色谱法。这项技术用于纯化生物分子。在色谱柱(固定相)上,首先分离样品,然后使用洗涤缓冲液(流动相)(图1)。确保它们流过玻璃纤维支架上柱子中的材料。样品以时间和体积相关的方式积累在设备底部[7]。

      
  离子交换色谱法


  离子交换色谱是基于带电蛋白质组和固体支持材料(底物)之间的静电相互作用。基质对待分离的蛋白质具有相反的离子负载,蛋白质与色谱柱之间的亲和力是通过离子键实现的。通过改变缓冲溶液的ph值、离子盐浓度或离子强度,将蛋白质从色谱柱中分离出来。带正电荷的离子交换基质称为阴离子交换基质,它可以吸附带负电荷的蛋白质。与带负电荷的基团结合的基质称为阳离子交换基质,吸附带正电荷的蛋白质。图2) [9]。

   
  凝胶渗透(分子筛)色谱法
       

  这种方法的基本原理是利用含葡聚糖的材料,根据大分子的大小差异来分离大分子。该程序主要用于测定蛋白质的分子量和降低蛋白质溶液的盐浓度。在凝胶渗透柱中,固定相由具有小孔的惰性分子组成。含有不同大小分子的溶液以恒定的流速连续通过色谱柱。大于孔隙的分子不能渗透到凝胶颗粒中,它们被限制在颗粒之间。较大的分子穿过多孔颗粒之间的空间,并在柱内快速移动。比孔小的分子扩散到孔中,随着分子变小,它们离开色谱柱的保留时间成比例地延长(图3) 。sephades型是最常用的色谱柱材料。此外,葡聚糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺也用作柱材料。

       
  亲和色谱法
     

  这种色谱技术用于纯化酶、激素、抗体、核酸和特定蛋白质。能与特定蛋白质(葡聚糖、聚丙烯酰胺、纤维素等)形成复合物的配体。)与色谱柱的填充材料相结合。与配体形成复合物的特定蛋白质附着在固体支持物(基质)上并保留在色谱柱中,而游离蛋白质则离开色谱柱。然后结合的蛋白质通过改变ph值或加入盐溶液来改变其离子强度,从而离开色谱柱(图4) 。纸色谱分析法


  纸上的色谱支持材料由一层高度饱和的水纤维素组成。在这种方法中,厚厚的滤纸形成支撑,水滴在其孔隙中沉淀,形成静态“液相”。流动相由放置在显影罐中的合适流体组成。纸色谱是一种液-液色谱。


  薄色层分离法


  薄层色谱是一种“固液吸附”色谱。在该方法中,固定相是涂覆在玻璃板上的固体吸附材料。用作吸附材料的所有固体物质。可以使用柱色谱(氧化铝、硅胶、纤维素)。在这种方法中,流动相向上移动通过固定相。并且通过溶剂的毛细作用向上移动到浸透了溶剂的薄板。在此过程中,它还使用移液管以不同的流速向上推动之前落在板下部的混合物。从而实现分析物的分离。这种向上运动的速度取决于材料、固相和溶剂的极性。


  当样品分子无色时,可以通过荧光、放射性或特定化学物质产生可见的有色反应产物,以确定它们在色谱图上的位置。可见颜色的形成可以在室内光或紫外光下观察到。混合物中每个分子的位置可以通过计算分子和溶剂之间的距离比来测量。测量值称为相对迁移率,用符号r  . f  . r  . f  .表示.数值用于分子的定性描述。


  气相色谱分析


  在该方法中,固定相是放置在装置中的柱,其包含吸附在惰性固体表面上的液体固定相。气相色谱是一种“气液”色谱。它的载体相由气体组成,如氦或n  2。惰性气体流动相在高压下通过色谱柱。待分析的样品被蒸发并进入气态流动相。样品中包含的成分分散在固体载体上的流动相和固定相之间。气相色谱是一种简单、多方面、高灵敏度、应用迅速的技术,可用于极其优异的微小分子分离。它用于分离极少量的分析物。


  染料配体色谱法。


  这项技术的发展是基于嘌呤核苷酸,嘌呤核苷酸已经证明许多酶可以结合到汽巴隆蓝f3ga染料上。带负电荷基团的平面环结构与nad相似。通过证明汽巴隆蓝f3ga染料与腺嘌呤和nad核糖结合位点的结合,已经证实了这种类比。这种染料是腺苷二磷酸核糖的类似物。这种吸附剂的结合能力比其他吸附剂强10-20倍。在合适的酸碱度条件下用高离子强度的溶液洗脱,利用吸附剂的离子交换特性将吸附的蛋白质从柱中分离出来。疏水作用色谱


  在该方法中,制备作为柱材料的吸附剂用于亲和层析中的配体结合。hic技术是基于侧链之间的疏水相互作用结合色谱基质。


  假亲和色谱。


  一些化合物如蒽醌染料和偶氮染料可以用作配体,因为它们对脱氢酶、激酶、转移酶和还原酶具有亲和力。这种色谱最著名的类型是固定化金属亲和色谱(imac) 。


  高压液相色谱


  使用这种色谱技术可以在短时间内分析和纯化许多分子,在氨基酸、碳水化合物、脂质、核酸、蛋白质和类固醇的分离和鉴定中产生完美的结果和其他生物活性分子。在高效液相色谱中,流动相以10-400个大气压和高流速(0.1-5厘米/秒)通过色谱柱。在该技术中,使用小颗粒并对溶剂流速施加高压可以提高高效液相色谱的分离能力,并在短时间内完成分析。

  高效液相色谱设备的基本组成部分是溶剂库、高压泵、市售色谱柱、检测器和记录仪。分离的持续时间在计算机系统的帮助下被控制,并且材料被累积[25]。


  色谱在医学中的应用领域。

  色谱对生物化学家来说是一个有价值的工具。此外,它可以很容易地应用于在临床实验室进行的研究。例如,纸层析被用于鉴定体液中与遗传代谢紊乱相关的某些类型的糖和氨基酸。气相色谱法用于在实验室中测量类固醇、巴比妥酸盐和脂类。色谱法也被用来分离维生素和蛋白质。


  结论

  最初,色谱被用来根据颜色分离物质,就像草药色素一样。随着时间的推移,其应用领域得到了极大的拓展。目前,色谱法被认为是一种极其灵敏和有效的分离方法。柱色谱是一种有用的分离和测定方法。柱层析是根据蛋白质的特性实现的蛋白质纯化方法。此外,这些方法用于控制蛋白质的纯度。高效液相色谱具有许多优点,尤其是灵敏度高、周转快。它可以作为一种定量方法来纯化氨基酸、蛋白质、核酸、碳氢化合物、碳水化合物、药物、抗生素和类固醇。

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