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荧光光谱仪的工作原理-凯发k8官方网站

发布时间:2021-08-16

  荧光是一种现象,即分子吸收其吸收带中的光,然后在其发射带中以更长的波长发射该光。这种现象可以用来识别、定量和观察化学活性,并且由于其高灵敏度、简单性和特异性而成为一种流行的方法。荧光是一种辐射发射,当分子在具有跃迁偶极矩的波长吸收能量时发生。提供给基态分子的激发能量促使光子进入激发态单线态,然后它们衰减到激发态单线态的最低振动能级。这种能量被进一步松弛回到分子的基态,光子在这个过程中被发射出来,如图1所示。


  荧光分子还可以经历三种非辐射弛豫方法,其中激发能量不转化为光子:(1)内部转化,(2)外部转化,(3)系统间交叉。当两个电子态之间的能隙相对较小,电子从较高的电子态跃迁到较低的电子态时,就会发生内部转换。这里,能量被转移到电子态的振动模式。由于振动过程是热驱动的,荧光强度会随着温度的升高而降低。在外转换中,能量通过与荧光团环境中溶质分子的碰撞猝灭而损失。当单重激发态和三重激发态的振动能级在能量上重叠,电子从最低单重激发态跃迁到第一个受激三重态时,就会发生系统间交叉。回到基态时发射的光子称为磷光(图1)。三重态的能量低于单重态,因此磷光峰出现在比荧光更长的波长。因为这些跃迁也是被禁止的,所以磷光寿命更长(~10三重态能量比单重态能量低,所以磷光峰在比荧光更长的波长被发现。因为这些跃迁也是被禁止的,所以磷光寿命更长(~10三重态能量比单重态能量低,所以磷光峰在比荧光更长的波长被发现。因为这些跃迁也被禁止,磷光的寿命(约10-410-2秒)比荧光(约10-910-6秒)长。更长的寿命还会通过氧猝灭、溶剂迁移和分子间碰撞导致热失活,因此室温下通常不会观察到磷光,因此样品必须在液氮温度下冷却。


  啤酒定律与浓缩效应

  虽然吸收发生在不到10 -15秒内,但从激发态到基态的弛豫过程要慢得多。因此,与吸收不同,荧光可以提供荧光团与周围分子和溶剂相互作用的信息。


  荧光强度与激发强度成正比

  f=2.303 * k  * i  0 * bc


  其中k是基于仪器几何形状的常数,i  0是激发光的强度,e是荧光团的摩尔吸收率,b是光程长度,c是浓度。由于荧光强度与入射光强度不成比例,如在吸收测量中,荧光灵敏度高得多,因为它不受仪器区分入射强度和检测强度的能力的限制。因此,测量需要较小的浓度。只有当样品的吸光度小于0.05 au时,上述方程才是线性的。如果样品浓度过高,发出的光会被荧光团重新吸收,从而减弱波长较短的荧光信号。激发光可能无法完全穿透高浓度样品的整个宽度,这也可能导致荧光强度降低。

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